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正文:
亲和层析
一些蛋白质的一个重要的特点是不通过共价作用就可以与配体紧密
连接。这个性质被用于纯化,基本原理是配体通过共价作用连接到基质
上。当流动相流过柱子时,与配体有强亲和力的蛋白质结合到配体上,
它们流过柱子的速度减慢,与配体无亲和力的蛋白质直接流过柱子。这
种方法为纯化提供了一种独特的选择途径。亲和层析有一个很大的优点
就是利用了蛋白质的生物化学性质而不是蛋白质的物理性质。
亲和层析依赖于蛋白质与不移动的配体之间的相互作用。结合必需
足够特异以区分不同的蛋白质,但如果结合非常紧密(大的亲和力),从
柱子上洗脱蛋白质也是一个问题。主要的洗脱方法是竞争蛋白质的结合
位点。因此,常用的洗脱方法是加入外来的或自由的配体与共价连接的
配体竞争与蛋白质的结合位点。第二种方法是改变溶液环境到足够阻碍
蛋白质与配体之间的结合。在这些条件下,蛋白质不再表现与配体间很
强的亲和力从而被洗脱。后一个方法中不能用可以使蛋白质变性的溶液
环境,一般只是适当地改变溶液的pH与离子强度。酶很适合于这种层析
方法,协同因子如NAD、NADP和ADP无疑被用作亲和层析中的配体。
亲和层析的一个限制因素是必须有办法把配体共价连接到基质上。
这一共价修饰又不能破坏它与蛋白质之间的亲和力,还必须在层析过程
中使用中性的温度、pH以及溶液环境下使之能够稳定存在而不被破坏。
最近,有大量的基于亲和层析的分离方法出现,因为表达系统的发展可
以产生带组氨酸标签的蛋白质以及融合到其他蛋白质如谷胱苷肽S转移
酶或麦芽糖结合蛋白的蛋白质。组氨酸标签可以加到蛋白质N端或C端并
结合到
金属螯合的含有亚乙酸配体的柱子上。同样,谷胱苷肽S转移酶
可以结合到谷胱苷肽配体上,谷胱苷肽配体可以共价结合到琼脂糖凝胶
上。
出自http://www.bjsgyq.com/
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