显微镜,金相显微镜,生物显微镜,北京地区专业供应商

点击查看产品参数和报价--丨--

正文:

一、萤光抗体的原理

　　萤光抗体法 (Fluorescent Antibody Technique) 为应用组织化学及免疫学的方法，在萤光色素物质结合抗体的帮助下，使特异的抗原抗体複合物 (Antigen-Antibody Complex) 显现在组织切片或细胞涂抹片，因此本法主要靠萤光色素及紫外光源。萤光色素是一种以紫外线激发照射而放出更长波长的物质。当一种物质被激发而发光叫做萤光。如果能源被切断仍继续发光，叫做燐光 (Phosphorescence)。萤光物质能标附或结合于抗体球蛋白而不干扰其免疫学上的特异性及其结合抗体的能力。
　　 萤光抗体直接法可应用于任何抗原的物质，不管在细胞内或细胞外、原虫、细菌、立克次氏体、病毒、组织抗原、激素或酵素。
　　另一种为萤光抗体间接法，是以未经标示之已知抗体和已知或未知抗原反应。这个抗体叫做第一次抗体 (First Antibody)，第二步再以标示之特异抗球蛋白抗体 (Second Antibody) 来染。如果有特异萤光出现，即可间接证明第一次抗体已与特异抗原结合。
　　还有一种为补体法，则以萤光标示之抗补体抗体来染 " 抗原－抗体－补体複合物 "(Antigen-Antibody-Complement Complex)。
(一)  萤光抗体法的特性
(The Characteristics of Fluorescent Antibody Technique)
1.  特异性 (Specificity)
　　和萤光色素结合的抗体球蛋白是一种对抗原有很高特异反应性的蛋白，因此，标示抗体仅和特异相对抗原 ( 细菌、病毒、组织或细胞 ) 反应，且亦可知道病毒在细胞之位置及包涵体 (Inclusion Body) 和病毒颗粒之关係。
2.  迅速性 (Rapidity)
　　染色步骤及萤光显微镜观察能于 1～2 小时内完成。故如猪假性狂犬病、猪瘟、狂犬病或其他已有标示抗体者，当病材送达后，1～2 小时即可知是否受到该病的感染存在。如果标本内可检出抗原即可以肯定的做诊断，这比培养或动物接种更节省时间。但是若为阴性，必须与其他诊断法併用来做最后诊断。
3.  敏感性 (Sensitivity)
　　萤光抗体之敏感性和 ELISA 法很相似，而高于中和反应及血球凝集反应试验。由于特异萤光的强度无法定量，故未能实际估计其敏感性。以间接法而言，仅第一次抗体 2 单位即能检出抗原 ( 若抗原量足够 )。此外本法之敏感性亦受抗原量之多寡影响。Coons(1956) 曾报告最少必须 0.8×l0-4μg/mm2 的肺炎球菌荚膜多醣体的浓度，才能以萤光抗体检出。Pressman et al.(1958) 谓 5μ 的组织切片中，其能检出之抗原浓度约为 1.4×l0-4μg/mm2。萤光抗体法之间接法及补体法之敏感性约比直接法高 5～10 倍。
(二)  必要条件 (Prerequisites)
1.  抗原 (Antigen)
　　材料的准备必须儘量避免能和抗体反应之抗原的损失。材料之前处理及固定必须能移去脂肪或其他干涉「抗原－抗体」反应的物质，且不影响抗原物质固定于玻片。有时，固定作用会破坏抗原性与增强自发及非特异萤光，而未处理之材料因保持抗原性反而较易于观察，因此染色必须有对照材料以资比较观察。
2.  抗血清 (Antiserum)
　　非常强而特异的萤光抗体往往带很弱之电荷。抗血清之力价必须很高，须不含被检组织之抗体或含量很低。抗血清中所含之对抗正常组织的抗体，必须由该组织或由丙酮乾燥製备之天竺鼠肝粉来处理吸收掉。若抗体之力价很高，则可稀释抗体来降低所含之其他抗体的干扰。製备抗体之免疫动物必需使用SPF动物来增加抗体之特异性。标示后的抗体必需经过 DEAE-Cellulose(0.14 M NaCl 在 0.0l M Phosphate buffer pH 7.3) 除去多带 FITC 之抗体。
3.  标示抗体 (Labelled Antibody)
　　本法中所使用之萤光色素物质和抗体球蛋白很容易结合，其稳定性高，不会影响抗体之结合反应，具有相当好的适量范围 ( 萤光色素效率 )，且最高吸收及最低放出之波长有很大不同。
4.  反应的条件 (The Condition of Reaction)
　　萤光抗体之稀释、作用温度、缓冲盐水之浓度、pH 值及水洗等都要小心控制，染色价必须事前由已知含量之抗原材料来测定，且染色液必须含 2～4 倍染色价。
5.  对照 (Control)
　　为确保染色反应之特异性，必须有下列的对照：
(a)  抗原：(1) 正常未感染组织 (2) 含特异抗原之组织或 (3) 其他特异性抗原之组织。必须对照组之 (1) 及 (3) 都没有萤光出现，而 (2) 却有萤光出现。
(b)  抗体：在抑制试验中，以标示异质性抗体染色者应为阴性。
6.  观察 (Read)
　　萤光显微镜须有上面照光装置 (Epi-Iliuminater)、暗视野聚光器 (Dark-Field Condenser)、Xenon Lamp 或高压力之水银灯，多种滤光器及照相装置。紫外线的调整、滤光镜及聚光器的选择以及被检材料暴露观察时间等是否正确，都要注意，否则会影响判读之结果。
(三)  萤光抗体法遇到之困鸡
1.  自体萤光 (Autofluorescence)
　　组织或细胞产生之自然萤光 ( 即自体萤光 )，为白色或蓝紫色，和特异萤光极易区别。较厚之组织切片易出现自体萤光。经福马林固定及石蜡包埋处理后亦易引起。
2.  外源特异萤光 (Extraneous Specific Fluorescence)
　　当免疫原不纯时 ( 即有其他抗原污染，如蛋白质、异质性抗原或该动物感染其他微生物 )，会发生此型之萤光。一般以正常组织粉末未能吸收之。例如：以自然感染 Sendai Virus 的小白鼠用于製造抗日本脑炎血清而以 FITC 结合，并应用来测定病毒抗原之位置时，会造成未感染日本脑炎病毒之呼吸道细胞，却有特异萤光出现之现象，故一般皆以 SPF 动物製造特异抗体，或以单源抗体 (Monoclonal Antibody) 做特异抗体。
3.  非特异萤光 (Nonspecific Fluorescence)
　　非特异萤光可能来自未结合且未被除去之多馀标示色素、抗体结合太多的色素、组织固定之不当或材料染色过程中乾燥掉。小心控制球蛋白及 FlTC 之浓度、反应时间、温度、Gel Filtration 及 DEAE－cellulose 行 Column Chromatography (0.14 M NaCl in 0.0l M Phosphate Buffer，pH 7.3) 等条件，所得之染色结果非特异性最少，而其 Fluorcein / Protein Ration 为 ≦ 2.5 其算法如表一。以紫外线之吸收来计算 FITC Conjugates 之公式如下：
Con. of FITC－Protein(mg/ ml)＝OD 280－(0.36×OD 496)
　　　　　　　　　　　　　－－－－－－－－－－－
　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.4