标题：显微镜下细胞黏菌形态观察步骤-专业制造金相显微镜
信息分类:站内新闻
作者:yiyi发布
时间:2012-11-13 23:05:58
将本页加入收藏
下一篇：普通光学显微镜,需测量细胞大小,购买什么配件
上一篇：光学和相衬显微镜观察生物观察结果的区别？
点击查看产品参数和报价--丨--
---
---
---
正文:
显微镜下细胞黏菌形态观察步骤
〈1〉生活史的观察
〈2〉 孢子与孢子囊柄细胞的观察
利用灭菌后的解剖针挑起一株孢子囊体于载玻片上，加一滴水盖上盖玻片，以光
学显微镜观察，使用显微测量尺测孢子大小、极粒的有无和孢子囊柄顶端形态及基部宽度与相关图鑑做对照，以辨别其种类
※每一形态特征取约20个测量，均逢机选取，再求出大小范围、平均值及标準差
抽取DNA
1. 取一tube(微量离心管)并加入50μl ddH2O(经过二次灭菌过的纯水)
2. 探针尖端以酒精高热消毒，从培养皿挑入50~100个细胞黏菌的孢子囊堆(sorus)
3. 加入sea sand(海砂)适量，以研磨棒研磨数次
4. 加入500μl预热65℃之2﹪CTAB buffer (1.4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM EDTA, 2% PVP-40【w/v】, 20 mM cetyl trimethyl ammonium bromide【CTAB】；and 0.5% 2-mercaptoethanol【v/v】)，略研磨以混合之
5. 加入3μl 2-mercaptoethand(hood)，置于65℃水浴槽水浴十分钟以破坏细胞壁
6. 加入500μl dichlormethane : isoamyl alcohol(24:1)(hood)，以纸巾覆盖震盪
7. 室温下离心13000rpm 7mins，抽取上清液于新tube
8. 加入300μl isopropanol(hood)，以纸巾覆盖震盪，室温下离心13000rpm 7mins以沉淀DNA
9. 去除上清液，加入500μl wash buffer(76% ethanol, 10 mM ammonium acatate)去除盐类物质静置二分钟
10. 室温下离心13000rpm 7mins，去除上清液并倒置烘乾
11.加入30μl ddH2O，放在37℃培养箱培养30分钟
※完成后最好直接进行聚合酶连锁反应，否则需要冷藏保存
（一）聚合酶连锁反应 (Polymerase chain reaction，PCR)转录ITS1区域步骤
1. 取一新tube依序加入下表溶液(单位μl)：
2. 各取45μl加入每个抽好DNA的tube(不能有气泡)
3. 置于聚合酶反应器进行40循环 ※保存需冷冻
（二）PCR产物检测(电泳)
1. 取一块用ethidium bromide染色的2﹪洋菜胶连同胶盘置入电泳槽，注入1x TBE buffer直到液面略淹过洋菜胶
2. 取一张乾淨的parafilm，滴2μl DNA loading dye及2μl DNA marker混合后滴入洋菜胶第一格样品槽作为标记，藉不同大小的DNA分子相异的位移鑑定产物大小
3. 混合 2μl DNA loading dye及5μl PCR产物分别滴入样品槽
4. 进行电泳约25分钟，取出胶片置于紫外线透视观察箱下拍照纪录
（三）DNA定序
将所得的PCR产物采用自动定序分析仪(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer、ABI 3730 DNA Analyzer , USA)，以定序套组(ABI PRISM BigDyeTM Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)进行PCR反应，来进行菌株的定序
出自http://www.bjsgyq.com/北京显微镜百科