显微镜,金相显微镜,生物显微镜,北京地区专业供应商

安非他命对NMDA在大白鼠大脑皮质神经细胞上所引起45Ca2+蓄积之作用

在大白鼠大脑皮质神经细胞培养中发生的细胞凋零的特征

1)安非他命是一种精神刺激剂，有关安非他命的中枢神经作用的研究过去大都着重在与多巴胺神经传导系统的关系，然而最近有许多证据显示安非他命所造成的行为敏感化作用 (behavior sensitization) 能被N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA) 的拮抗剂所阻断， NMDA受体的活化参与了安非他命的中枢神经的作用。过去本实验室利用[3H]TCP受体结合的方法及45Ca2+ accumulation的实验，观察安非他命对NMDA受体的作用，结果显示安非他命可以直接抑制NMDA受体的活化。在本实验中我们将再次确认安非他命可以抑制NMDA所引起的45Ca2+ accumulation，并且比较右旋 (d-amphetamine)、左旋安非他命 (l-amphetamine)及甲基安非他命(Methamphetamine)对NMDA所引起的45Ca++ accumulation是否具有抑制作用及其个别的强度。

结果显示，安非他命是NMDA的拮抗剂且安非他命对NMDA引起的45Ca2+ accumulation有两阶段的抑制作用。而不同结构的安非他命对NMDA引起的45Ca2+ accumulation的抑制作用强度是差不多的。

(2) Apoptosis (细胞凋亡)又称为Programmed cell death (计划性细胞死亡)，顾名思义，它是由细胞自行调控死亡，是一种选择性的主动死亡方式。本实验利用大白鼠大脑皮质神经细胞的培养观察apoptosis的现象，我们发现随着培养天数的增加，神经细胞的密度渐渐降低而且有许多细胞呈现apoptosis的特征包括神经细胞缩小、核质浓缩、及产生许多apoptotic bodies等。因此我们判定这种神经细胞培养有自生性的apoptosis，根据此种观察，我们想要利用其它重要方法来确定此种判断。我们除了利用倒立式相位差显微镜直接观察并照下神经细胞的外型之外，并且以LDH response测量细胞毒性，及利用TUNEL assay 侦测apoptosis的细胞，以及利用RT-PCR的方法侦测一些mRNA的表现量，包括bax、c-fos、c-jun等。此外，我们并分别在神经细胞离体外培养第6、12、18天时投与NMDA、MK-801、morphine、naloxone等药物观察它们对神经细胞的影响，瞭解他们是否会促进或抑制神经细胞的apoptosis。

结果发现大白鼠大脑皮质初代神经细胞培养 (rat primary neuronal cell culture)中有自发性的apoptosis，可作为一种研究apoptosis的模式。而且直接以显微镜及以TUNEL assay观察都发现：apoptosis细胞的数目会随着培养天数增加而上升。再侦测培养1到22天的细胞的mRNA，以ß-actin作为internal control，发现c-fos mRNA的量在第20天有明显的上升，但是NSE、NF-M、bax、c-jun mRNA在不同天数则没有明显差异。在第6天的culture上不论NMDA、MK-801、morphine、naloxone对细胞内LDH释放的量都没有明显的作用，细胞型态在不同时间也没有明显变化，但是投与NMDA与MK-801会降低c-fos mRNA的量。在第12、18的细胞投与NMDA与MK-801则会降低NSE和NF-M mRNA的量。在第12天、18天的culture上NMDA组的LDH值比control组高，在倒立式相位差显微镜下观察到NMDA组细胞外型呈现明显的necrosis，到24小时细胞已明显的死亡(Figure 27,29)，此时以TUNEL assay侦测apoptosis的细胞，发现neuron的数目较少，而且存活下来的细胞也几乎100%发生apoptosis。可见得NMDA会同时造成neuron的necrosis与apoptosis。