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正文:

2.样品染色　　
(1)准备正控制组：吸取 10 μL 含 200 至 400 个的孢子至玻片（Dynal 公司产品）上当作正控制组。　 　 (2)准备负控制组：吸取 50 μL 150 mM PBS 至玻片上当负控制组。　 　

(3)将上述玻片风干。　 　

(4)各加一滴的检测剂量（Detection Reagent）至样本玻片上。（Meridian 公司的测试套组或同级品）　 　 (5)加一滴的对比染剂量（Counterstain）至样本玻片上。（Meridian 公司的测试套组或同级品）　 　

(6)将玻片在暗处静置 30 分钟，最好是用一个可密封的塑料盒，盒内放置一张湿的纸巾。　 　

(7)加入一滴一倍的洗剂（wash buffer）,（此由 20 X 的洗剂稀释得来）。倾斜玻片，以清洁的纸巾及无菌吸管将多余的试剂吸去。注意不要碰触到样本且不得使玻片干燥。　 　
(8)加入 50 μL 的 DAPI 染剂至玻片上，染色一分钟。倾斜玻片，以清洁的纸巾及无菌吸管将多余的试剂吸去。注意不要碰触到样本且不得使玻片干燥。　 　
 (9)加入一滴的封片液盖上盖玻片，用纸巾吸去玻片周围多余的封片液。　 　

(10)以荧光为光源的微分干涉差显微镜进行镜检并计数，如果无法马上观察计数，样本玻片必须保存在 0 至 8 ℃ 的暗处，同时要有保湿的处理，不能使玻片干燥。

八、结果处理（一）显微镜镜检观察与计数　

1.正控制组的玻片在荧光显微镜下以 200 倍的倍率下观察，可见到苹果绿原虫。负控制组则否。　
2.隐孢子虫在显微镜下是有亮度的苹果绿颜色，大小约 4 至 6 μm，卵形或圆形。周围有一圈明亮的光环。　
3.将光源转为

DIC：原虫可能会有如下的特征：　　 (1)1 至 4 个清晰、天蓝色的细胞核　 　 (2)细胞质可染上蓝色　 　 (3)淡蓝色的细胞质、没有明显的细胞核　 　 （1）、（2）纪录为 DAPI ＋;（3）纪录为 DAPI －　

4.使用 DIC 显微镜观察非典型的隐孢子虫孢囊体：例如刺状物、柄、附属构造、洞、一或两个细胞核充满整个细胞、红色荧光的细胞质、结晶或孢子等。　 5.如果没有发现非典型的囊孢体构造，具苹果绿荧光之目标物可能为：　　
 (1)空的隐孢子虫孢囊体　 　 (2)模棱两可的隐孢子虫孢囊体　 　 (3)隐孢子虫孢囊体含有内容物如 1 ～ 4 个小孢子（sporozoites）在 1000 倍的放大倍率下 记录形状、量测大小及含有小孢子（sporozoites）之孢囊体的数目。　

6.梨形鞭毛虫在显微镜下为具亮度的苹果绿颜色，卵形或圆形，长为 8 ～ 18 μm，宽为 5 ～ 15 μm，周围有一圈明亮的光环。　

7.将 UV 光源转为 DIC 时：原虫会有如下的特征　　 (
1)2 至 4 个清晰、天蓝色的细胞核　 　 (2)细胞质可染上蓝色　 　 (3)淡蓝色的细胞质、没有明显的细胞核　 　 （1）、（2）纪录为 DAPI ＋;（3）纪录为 DAPI　

8.使用 DIC 显微镜观察非典型的梨形鞭毛虫卵孢子：例如刺状物、柄、附属构造、洞、一或两个细胞核充满 整个细胞、红色荧光的细胞质、结晶或孢子等。　 9.如果没有发现非典型的梨形鞭毛虫卵孢子，则将有亮度的苹果绿颜色的目标物应为梨形鞭毛虫的卵孢子。在 1000 倍的放大倍率下记录形状、量测大小及数目。

（二）复杂样本的分析　 1.如果样品的虫数过高 --- 超过 1000 / 公升，或是水中浊度过高，导致滤心的阻塞以致于无法进行流洗浓缩时，可以稀释的水样重新检验。　 2.如果水样的过滤体积无法达到规定的 10 公升，可用试剂水稀释至 10 公升再行过滤。　 3.如果采样至检验的时间超过规定之期限，则放弃此水样，重新采样送检。九、质量管理（一）每一实验室在进行本方法时均需建立质量保证计划。最基本之要求包括精确度、回收率等绩效测试 数据，并以添加样品及空白作持续性评估。实验室同时须建立绩效测试之评估基准，以评估分析数据结果之可靠性。（二）微量吸管校正　 1.微量吸管每年送外校一次，并保有外校结果纪录。如实验室技术人员经考核具校正能力，内校亦可。　 2.如对微量吸管之校正有疑问，可以 100 ％、50 ％、10 ％ 之试剂水以分析天平作校测试，误差在 1 ％ 以内仍可接受。十、精密度及准确度