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显微镜下细胞计数与活性判断

实验/实习目的

当显微镜下细胞增殖达到一定密度后，需要观察显微镜下细胞生长情形与计数显微镜下细胞，可以决

定是否为良好显微镜下细胞或者为死掉显微镜下细胞，方可继续继代显微镜下细胞。

实验/实习原理

组织培养显微镜下细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有

限的，所以当达到一定密度后，则需要分离出一部分显微镜下细胞和更新营养液。

实验/实习药品与设备

1、 无菌操作檯

2、 血球计数盘

(一)0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

(二)取0.4 gram trypan blue 溶于100 ml Ca2+ / 1Mg2+ free 1x phosphate

buffer saline (1 x PBS) 经0.2μm 孔径过滤器过滤后即可使用

3、 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)

4、 计数器(counter)

5、 低倍倒立显微镜

实验/实习内容与步骤

1、 血球计数盘：

(一)血球计数盘一般有二个chambers。

(二)每个chamber深度均为0.1mm。

(三)chamber中细刻9个1mm2大正方形。

(四)其中4个角落之正方形再细刻16个小格。

(五)当chamber上方盖上特製血球计数盘盖玻片后，每个大正方形之体积为

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1mm2 x 0.1mm=1.0 x10-4ml。

(六)使用时，计数每个大正方形内之显微镜下细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，

即为每ml中之显微镜下细胞数目。

2、 trypan blue exclusion存活测试：

(一)最常用之显微镜下细胞存活测试之原理为dye exclusion，利用染料会渗入死显微镜下细胞

中而呈色，而活显微镜下细胞因显微镜下细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。

(二)操作上一般使用蓝色之trypan blue染料。

(三)如果显微镜下细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。

3、

存活测试步骤：

(一)均匀打散显微镜下细胞成显微镜下细胞悬浮液。

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(二)剪出一小片石蜡膜。

(三)取20ml 0.4% trypan blue 于石蜡膜上。

(四)取20ml 显微镜下细胞悬浮液与石蜡膜上trypan blue 做等体积溷合均匀溷合。

(五)取少许溷合液﹙约20ml﹚自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻

片，于100倍显微镜下观察(10x物镜10x目镜)。

(六)活显微镜下细胞不染色，呈现透明显微镜下细胞形态，死显微镜下细胞则被染为蓝色。

(七)一般需分别计数3~5个大方格之活显微镜下细胞数以及死显微镜下细胞数，再除计数之大

方格数。

(八)一大格显微镜下细胞平均数乘以稀释倍数﹙乘以2，因与trypan blue等体积溷合﹚，

最后乘以104，即为每ml中显微镜下细胞悬浮液之显微镜下细胞数。

(九)若有显微镜下细胞位于边线上，只计上线与右线之显微镜下细胞﹙或计下线与左线之显微镜下细胞﹚。

(十)4大格*显微镜下细胞总数/ 4 (大格) x 2 (稀释倍数) x 104 = 显微镜下细胞数/ml。

*每一大格的体积 = 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm =1 x 10-4 ml。

(十一)也可用Coulter counter自动粒子计数器作自动计数，惟无法辨别死显微镜下细胞

或活显微镜下细胞。

4、 范例：

1.T75 monolayer culture製成10ml显微镜下细胞悬浮液，取0.02 ml溶液与0.02ml

trypan blue溷合均匀于试管中，取少许溷合液加入血球计数盘，计数四大

方格内之显微镜下细胞数目。

(1).活显微镜下细胞数/方格：55、62、49、59。

(2).死显微镜下细胞数/方格：5、3、4、6。

(3).显微镜下细胞总数 = 243。

(4).平均显微镜下细胞数/方格 = 60.75。

(5).稀释倍数 = 2。

(6).显微镜下细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 cells/ml。

(7).显微镜下细胞数/flask：1.22 x 106 x 10ml = 1.22 x 107 cells/flask。

(8).存活率：225 / 243 x 100％ ﹦92.6 ％。

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注意事项

1、 显微镜下细胞计数之误差：

(一)取样不均匀。

(二)显微镜下细胞充分溷合。

(三)显微镜下细胞分布均匀。

(四)每一大格约10~60个显微镜下细胞取样误差比较小。

(五)稀释或浓缩。

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