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细胞冷冻保存实验试验步骤？！

1.从冰箱中取出要用到的材料，并利用37℃水浴槽回温。

2.关闭无菌操作台UV灯，并开启无菌操作台风扇及日光灯。喷酒精于无菌操作台平面，并擦拭乾淨，以达到消毒效果。

3.将要使用到的物品，喷酒精消毒，并擦拭乾淨，再带入无菌操作台内。

4.于无菌操作台内配置5% DMSO (1 DMSO比19 FBS溷合)，并放在冰上。

5.将要冷冻保存的细胞，喷酒精消毒，并擦拭乾淨，再带入无菌操作台内。

6.将玻璃吸管接再pump的塑胶吸管上。

7.去除细胞培养液，再加入PBS清洗细胞，并来回轻轻摇摆几次。

*15公分Dish，加入10ml PBS；9公分Dish，加入5ml PBS。

8.去除PBS，再加入Trypsin。

*15公分Dish，加入5ml Trypsin；9公分Dish，加入3ml Trypsin。

9.放入细胞培养箱 (37℃) 3~5分钟，以加速酵素作用，使附着型细胞漂浮起来。

10.轻轻拍打几次，再利用显微镜观察细胞是否全部漂浮起来。

11.喷酒精消毒，并擦拭乾淨，再带入无菌操作台内。

12.加入与Trypsin同样体积的细胞培养液，并来回轻轻摇摆几次溷合，以综合酵素，阻止酵素继续反应。

13.吸取细胞液放入离心管。

14.抽取1ml细胞液放入微量离心管。

15.计算细胞数。

16.细胞液给予离心。 (转速1000rpm，温度20℃，5分钟)

17.去除上清液，加入配製好的5% DMSO。

18.利用微量吸管来回吸取，使细胞与5% DMSO完全平均溷合。

19.以1ml体积细胞液，个别分装到抗冻管内，并给予标记细胞，代数及日期。

20.冷冻保存:冷冻管置于4℃，30分钟→移至-20℃，30分钟→移至-80℃，隔夜→移至液态氮桶长期保存。

*或直接放入Freeze Container，移至-80℃，隔夜→移至液态氮桶长期保存。

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