显微镜,金相显微镜,生物显微镜,北京地区专业供应商

内生荷尔蒙组织上定位步骤

光学显微镜下镜检及照相

1. 取样与固定
随机选取愈合组织诱导时期及移至分化培养机后0、3、6天的愈合组
  织以FAA固定液〔福尔马林：冰醋酸：70％酒精＝5：5：90（v/v/v）〕于
  室温下固定24小时，再换至70％酒精中，置于4℃冰箱贮存。
2. 脱水
将样品以第三级丁醇（t-butanol）和乙醇的溷合液（TBA-series）进行
   逐步脱水，操作流程如下：
(1) t-butanol：95％ethanol：H2O（10：40：50）﹕2小时
(2) t-butanol：95％ethanol：H2O（20：50：30）﹕2小时
(3) t-butanol：95％ethanol：H2O（35：50：15）﹕2小时
(4) t-butanol：95％ethanol（55：45）﹕2小时
(5) t-butanol：100％ethanol（75：25）﹕2小时
(6) t-butanol （内含少量safranin使样品染成红色，易于观察组织位置与方向）﹕2小时
(7) t-butanol﹕隔夜
3. 渗腊及包埋
固定瓶中加入约半量的石腊，于烘箱中约60℃下使之融解，待烘箱降温，使石腊自然冷却凝固。将已处理至第三级丁醇的样品，放入含有石腊之固定瓶中，再加入适量的第三级丁醇，放回烘箱中，调整温度至55℃，使第三级丁醇逐渐挥发，并使石腊融解而进行渗腊。待第三级丁醇挥发完全后，再换一次石腊，继续渗腊，待样品渗腊完全后，再进行包埋。
将完成渗腊的样品自烘箱取出，用酒精灯加温使石腊不致于冷却凝结。将包埋用的磁盘先涂上一层甘油（glycerol），同时置于酒精灯上加温，以维持磁盘的温度约50℃左右防止石腊倒入时会太快凝结。将固定瓶中的石腊与样品一同倒入磁盘中，在融腊状态下调整样品在磁盘中的位置及方向，待其完全凝固，再自磁盘中取出整个腊块进行切片。
4. 切片
首先将清洁的载玻片浸入黏着剂《adhesive：0.5％gelatin、0.05％chrome album、少数防腐剂（thymol）》，十五分钟后取出自然干燥。将已包埋好的样品腊块修饰成适当大小的立方块，黏于软木塞并置于切片台上。以10 m的厚度进行切片，同时将前述之载玻片上滴加适量蒸馏水，再将腊带置于蒸馏水上，移至约45℃的温板上，待腊带延展之后，将蒸馏水吸干，将样品放在40℃-45℃的环境下，烘干后即可进行以下的试验。
5. 脱腊及染色
制备完成的样品切片，其脱腊及染色的步骤如下：
(1) xylene  2次，10分钟/次
(2) xylene：100％ 酒精 （1：1）  1次，10分钟/次
(3) 酒精系列：浓度序列分别为100％、95％、85％、75％、50％                          各1次，5分钟/次
(4) 1％safranin（溶于50％酒精中）             1次，2小时
以蒸馏水将多余的染剂洗除，即可进行组织免疫的试验。
6. 组织免疫化学法
本试验依据Brandtzaeg（1982）、Knox（1982）、Grzanna（1982）、
   Burns（1982）等人的方法稍加修饰，其操作步骤如下：
(1) 将已染色的样品置于免疫反应盒中，加入蒸馏水浸润3次（10分 钟/次），再以TBST缓冲液（Tris-Buffer Saline-Tween 20, TBST，附注1）浸润3次（10分钟/次）。
(2) 添加一级抗体（初级，primary antibody）
 将反应盒中的TBST缓冲液尽量倒干，加入一级抗体（附注2），
 置于4℃、黑暗中反应24小时。
(3) 添加二级抗体（二级，secondary antibody）
 将一级抗体倒出，以TBST缓冲液清洗3次（10分钟/次），再将盒中的TBST缓冲液尽量倒干，将样品换至新的反应盒中，加入二级抗体（附注3），置于4℃、黑暗中反应12小时。
(4) 添加SAP酵素
 将二级抗体倒出，以TBST缓冲液清洗3次（10分钟/次），再将盒中的TBST缓冲液尽量倒干，将样品换至新的反应盒中，加入SAP
 溶液（附注4），置于4℃、黑暗中反应5小时。
(5)呈色
将SAP溶液倒出，以TBST缓冲液清洗3次（10分钟/次），再将盒中的TBST缓冲液尽量倒干，将样品换至新的反应盒中，加入呈色剂（附注5、6），置于室温、黑暗中进行呈色反应，约2小时，依呈色之深浅调整呈色时间。
7. 封片与观察
(1) 用蒸馏水将多余的呈色剂洗除。
(2) 将样品置于50％、75％、85％、95％酒精，各1次（5分钟/次），再
   置于100％酒精中3次（10分钟/次）
(3) xylene：100％酒精（1：1），2次（10分钟/次）
(4) xylene 2次（10分钟/次）
(5) 以Entellen胶（Merck）封片，于光学显微镜下镜检及照相。
附注1. TBST缓冲液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、0.3％Tween 20 （v/v），调整pH值为8.2。
附注2. 一级抗体药品来源及配制
PAb-IAA：购自Phytoscience，Catalog No.AC312（1 mg/瓶）
PAb-ABA：购自Phytoscience，Catalog No.AC122（1 mg/瓶）

上述单株抗体由老鼠血清取得。
将各瓶一级抗体加入1 ml TBS 缓冲液及1 ml glycerol，溷合均匀，每50 l 分装至小离心管作为储存液，置于-20℃冰箱中。使用时，将贮存液以TBST缓冲液稀释500倍（v/v）。2种荷尔蒙的稀释倍数皆相同。
附注3. 二级抗体药品来源及配制
二级抗体购自PIERCE，代号：31800（2 mg/ml/瓶），为山羊抗老鼠血清（IgG（H＋L））抗体，其上接有biotin。使用时以TBST缓冲液稀释1000倍（v/v）。
附注4. SAP溶液药品来源及配制
SAP 购自PIERCE，代号：21324（1 mg/瓶），可与biotin 联接。先以2 ml 蒸馏水溶解作为储存液使用时将贮存液以TBST缓冲液稀释1000倍（v/v）。
附注5. 呈色剂
Nitro blue tetrazolium chloride（NBT）：购自PIERCE，代号：34035，每0.5克溶于10 ml 70％ dimethylformamide中。
5-Bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate（BCIP）：PIERCE代号：34040，每0.5克溶于10 ml 100％ dimethylformamide中。
附注6. 使用液配制：取100 l NBT及50 l BCIP加入15 ml的碱性磷酸酵素缓冲液（alkaline phosphatase buffer），必需新鲜备制使用。
alkaline phosphatase buffer﹕100 mM NaCl、5 mM MgCl2•6H2O及100 mM Tris，调整pH值为9.5

光学显微镜下镜检及照相

点击咨询： 　　
有任何疑问可咨询电话： 010-64034191 / 010-84021761