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雷射扫描雷射扫描共轭焦显微镜

1. 何谓雷射扫描共轭焦显微镜

        在一般显微镜下所观察的影像，都有来自聚焦面 ( focal plane ) 及 非聚焦面 ( out-of focal plane ) 的光，故所提供的影像品质解析较差，也无法一层一层的深入样品作显微观察。

        共轭焦显微技术利用通过光学针孔光圈 ( pinhole ) 蒐集来自样品聚焦面的光所行成的影像，将非同一聚焦面的光排除于光学针孔光圈外所形成的共轭焦点影像( confocal image )，去除传统显微镜影像的迷光 ( stray light ) 能提供更高的光学解析，提供更佳的 axial 及 lateral 解析 ( point spread function )。(见图 1)

        透过此种技术，使用人员可任意依照样品的厚度，指定样品的上下点位置，设定每一光学切片的厚度，做连续的光学断层扫描 (如图 2) ；最后，可重组为一个立体影像 (如图 3) 、连续式的3D电影放映 (如影片 1) ，也可作各种角度的旋转或切面观察 (如影片 2) 。 

2. 雷射扫描共轭焦显微镜系统的组成

        雷射扫描共轭焦显微镜系统，主要是由包含 A. 雷射光源  B. 显微镜  C. 共轭焦扫描器  D. 电脑操控工作站  E. 应用软体 所组成的。

A. 雷射光源

        雷射光源可提供极纯的单一波长 (monochromatic)，能量均一性 (high photon, energy)，且雷射光束俱有固定的相位 (coherence)，这些特性使得雷射光束可聚焦于一小点，所以可以有效的当作显微扫描光源。

　　雷射光源包括

a.可见光雷射光源 (visible laser)：

   包括离子雷射、氦氖雷射以及二极 体雷射。

b.紫外光雷射光源 (UV Laser)：包括氦镉雷射和氢离子紫外光雷射。

c.红外光雷射光源 (IR Laser )： Ti-sapphire Ultrafast laser。

(本实验室配备的雷射光源可参看「本实验室配备」)

B. 显微镜

·    目前的共轭焦系统绝大部份都可使用于正立或倒立显微镜，扫描器可切换组装于两款显微镜。

·    对UV和IR提供较高且较宽的波幅修正。

·    光学镜头使用高光学解析的高NA油镜，如PL-APO 40x/1.25 Oil，PL-APO 63x/1.32 Oil，PL-APO 63x/1.40 Oil，PL-APO 100x/1.32，PL-APO 100x/1.40。

C. 共轭焦扫描器

·    採用高解析的point-scanning 的扫描感测系统，基本上，有传统式的滤镜系统( filter-based )及新一代的分光光谱系统 (spectral-based)，本实验室的配备属于后者。

·    在滤镜系统设计上，主要是利用X-Y扫描镜来作样品X-Y座标取像，以Z-stage的升降作为Z-轴的纵身扫描取向，故X-Y-Z在配合时序的控制 (T) 即可作多样性的组合扫描应用，例如X-T，Y-T，XY，XY-T，XYZ，XYZ-T ……等。

·    扫描器的反射萤光侦测可使用CCD Camera或PMT (photomultiplier) 来作为光子的感测；至于一般穿透光影像撷取如相位差 (phase contrast)， 则是由安装于显微镜内的穿透光感测器所侦测的。

·    本实验室配备的扫描器为旋转式K型扫描器 (K-scanner)，能提供任何扫描速度的超高光学解析及多度空间的扫描 (nD : multi-dimentional scanning)，其解析度达4096 x 4096 x 4096像素。

D. 电脑操控工作站

·    电脑系统必须能稳定的操控所有软硬体。

·    使用人员应建立自己的影像处理工作站，以共轭焦系统为影像撷取中心，再将结果单向传输至个人的电脑作进一步的编辑处理。

E. 应用软体

·    高阶高速的影像处理软体，人性化的简易操作是发展的趋势。目前，都往 Windows NT 或Windows XP 的作业环境发展。

·    应用软体除了影像撷取及3D立体重建外，长时间影像撷取记录，细胞生理离子流应用，多重萤光分析，自动编辑程式等，都已是颇为成熟的发展。

3. 雷射扫描共轭焦多光子(双光子)影像技术

        在雷射扫描共轭焦显微镜的应用裡，一般都必须使用高能量 (较短波长) 激发光源来激发萤光染剂，因为此高能量才足以改变分子能阶，并在回到稳态时释出较长波长的萤光。所以，一般光源都使用高能量的单光子(single-photon) 可见光雷射 (Ar-Kr / He-Ne laser) 或紫外光雷射 (Ar-UV laser)。然而，萤光染剂的分子本身并不管此激发能量是否来自单光子、双光子或更多的光子所携带的能量，只要能量足够改变基态能阶即可。 (如图 4)

       因此，如果同时使用 2 个以上的双倍波长光子的能量，以能量相加的交互共同方式，来激发萤光染剂，则此共同的能量，就如同单光子的能量，足以改变能阶，并促使萤光染剂释出与单光子激发后所产生的相同波长的萤光，此即表示双光子技术。例如 : DAPI 的 Ex (激发光) : 359 nm，Em (释放光) : 461 nm，我们可使用单光子雷射 Ar-UV laser (约351 nm) 来激发，也可使用双光子雷射 Ti-Sapphire (约702 nm) 来激发，同样可得到相同波长 461 nm 的萤光。

       如果同时使用更多个光子共同来激发萤光染剂，使其产生与单光子激发后所产生的相同波长的萤光，此即表示多光子技术。

4. 使用双光子雷射扫描影像技术的优点

·  可依应用，适度取代紫外光雷射 (UV) :

·    紫外光雷射为单光子且造价昂贵。

·    紫外光因光伤害问题，无法使用于活体细胞。

·    紫外光极易散射 (high UV-scattering)，传输与穿透不易，会沉降在样品的表面层，就如同晒伤，致使样品热伤害。

·    紫外光造成毒害，致使 DNA 伤害。

·   增加取样的深度，能更深入样品裡层。

·   减低萤光漂白的速率，增加萤光观察与扫描时间。

·   使用多种染剂时，呈像无色差现象。

·    较容易将激发光与释出光的波长分开，萤光影像比较不会有重叠现象 (cross-talk)。

·    无须感测光针孔，所以反射萤光可 100% 被感测。

·    可使用绝大部份的萤光染剂，尤其是须使用紫外光光源所激发的雷射。

·    有效的应用于胞外或胞内离子流定量分析及萤光影像。

·    适用长时间影像撷取记录。

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