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梨形鞭毛虫与隐孢子虫检测方法 －过滤浓缩 / 免疫磁性抗体分离 / 免疫荧光抗体分析法

一、方法概要　　本方法应用于水中梨形鞭毛虫（Giardia）及隐孢子虫（Cryptosporidium）之定性与定量检测。用过滤方式将 10 ～ 20 公升水样中之梨形鞭毛虫与隐孢子虫收集于滤管上。以流洗液冲洗之后离心，经磁性抗体分离纯化，所得之虫体再以荧光标记之单株抗体及4’,6 - diamidino - 2 - phenylindole（DAPI）染色，在具有微分干涉差（Differential Interference Contrast, DIC）的荧光显微镜下观察计数。镜检作定量计数时必须就虫体之形状、大小、颜色与荧光强度与标准品作比对。

二、适用范围　　本方法适用于地表水、地下水、饮用水、水源水质等水样中梨形鞭毛虫及隐孢子虫之检测。但不适用于高浊度及含干扰物质水样之检测。
三、干扰
（一）无机物及有机物分解造成之碎片会在过滤、分离及镜检时造成各种程度的干扰；黏土会影响镜检之观察；净水处理系统中添加的化学物质如铁铝等混凝剂及高分子物质也会造成干扰。
（二）藻类及酵母菌所产生的非特异自发性荧光常会在荧光显微镜的观察时造成伪阳性的误判。
（三）溶液、试剂、玻璃容器及其它采样过程中可能因人为操作之失误而在镜检观察时造成误判，因此在实验流程必须同时进行一组方法空白即负控制组（Negative control sample）以作为比对。检验中如有更换试剂水或检测试剂时，亦应考虑进行空白组试验。
（四）在样品分离过滤的过程中有些藻类、细菌及原生动物会伴随着目的原虫同时被分离出来，造成镜检观察计数之干扰。
（五）水样、滤管、流洗液、离心浓缩及玻片可能含有影响卵囊及休眠体鉴别之因子，因此必须进行背景负控制组。

四、设备及材料
（一）10 至 15 公升的水桶，在 10.0、15.0 公升之处应有刻度。
（二）搅拌棒：不锈钢或塑料制，可作为水样搅拌用者。
（三）血球计数器及盖玻片：可作为原虫计数用者。
（四）拭镜纸：不含硅质者。
（五）PP 或 PE 材质之塑料平底螺旋试管，5 ～ 50 mL。
（六）滤管：商品名为 Envirochek 或其同级品，材质为 polyethersulfone。直径约 6 公分，长 21 公分，孔径为 1.0 μm，大约为 1300 平方公分的过滤面积。
（七）悬臂式震荡器：含有侧棒可以固定滤管，作为滤管中原虫之震荡分离者。
（八）采样器连接管：玻璃、PTFE 或 HDPE 材质，不易使原虫附着其上者。
（九）流量计及流量计流量控制阀：0.5 gpm 或每秒流速可控制在 0.3 公升者。或附有每秒 0.4 ～ 4 公升的流速附控制阀者。
（十）抽气马达：1 / 4～1 / 2 HP 均可。
（十一）磁性抗体样品混合磁座（MPC - 1、 MPC - M Dynal 公司产品或其同级品）：可作为免疫磁性抗体套组IMS混合之用。（十二）磁珠浓缩用试管 ：10 mL 之玻璃试管。（Dynal 公司产品或其同级品）
（十三）磁珠浓缩用离心试管：容量约为 10 mL 之塑料离心管。（Dynal 公司产品或其同级品）
（十四）磁珠解离用侧边扁平试管：6 × 125 mm，侧边 60 × 10 mm。（Dynal 公司产品或其同级品）
（十五）乳胶手套。（十六）量筒：10、100 及 1000 mL 可高压灭菌之量筒。
（十七）离心机：悬臂式、可以容纳 15 至 250 mL 圆锥底离心管。
（十八）离心管：圆锥底、有刻度、容量 1.5、50 及 250 mL。

（十九）显微镜：荧光显微镜，含 DIC 装置。20 倍（N.A. ＝ 0.4）至 100 倍（N.A. ＝ 1.3）放大倍率。DAPI 之激发波长：340 至 380 nm。
（二十）吸管：使用 5、10、25 mL 之无菌吸管、玻璃或塑料制。
（二十一）天平：分析天平，可以精称至 0.1 mg 者。　　　上皿天平，可以精称至 10 mg 者。
（二十二）pH 测定计。（二十三）恒温培养箱。（二十四）试管振荡器。
（二十五）抽气帮浦：可以维持在 25 in.Hg 以上者具有逆止阀及真空度量测计者。

五、试剂
（一）NaOH：试药级，6.0 及 1.0 N 及 0.1 N。
（二）HCl：试药级，6.0、1.0 及 0.1 N。
（三）溶剂：丙酮、甘油、乙醇及甲醇，均为试药级。
（四）试剂水：不含磁性物质者。
（五）磷酸缓冲溶液（PBS）：溶解 1 .07 g 的 Na2HPO4，0.39 g 的 NaH2PO4和 8.5 g 的 NaCl 至 800 mL 的稀释水中，再加至总量为 1000 mL。调整 pH 为 7.2，保存于 4 ℃ 冰箱中，期限为一星期。
（六）Laureth 12 溶液：称取 10 g 的 Laureth 12（PG 公司 06194 或同级品）加入 90 mL 的试剂水中，以加热板或微波炉加热溶解。分装 10 mL 至无菌小瓶中 ，室温下可储存 2 个月，4 ℃ 冰箱内可保存一年以上。
（七）1 M Tris 溶液：称取 121.1 g 的 Tris 溶于 700 mL 的试剂水中，以 1 N 的 HCl 或 NaOH 调整至 pH 为7.4。再加试剂水至总量为 1000 mL， 再调整 pH 至上述值。再以 0.22 μm 滤膜无菌过滤，于无菌塑料瓶，室温保存以二个月为限。
（八）0.5 M EDTA 溶液：称取 186.1 g 的 EDTA 溶于 800 mL 的试剂水中，以 6.0 N 的 NaOH 或 HCl 调整 pH 至 8.0，再加试剂水至 1000 mL，再以 1.0 N 的 NaOH 或 HCl 调整 pH 至上述值。4 ℃ 冰箱中保存期限为二个月。
（九）消泡剂 A：Sigma 公司 A5758，或同级品。
（十）流洗缓冲液：将（六）Laureth 12 溶液以试剂水稀释 100 倍，即 10 mL 的原液加 10 mL 的 Tris 、2 mL 的 EDTA 及 150 μL的消泡剂稀释至总量为 1000 mL。
（十一）IMS 免疫磁性抗体套组：Dynal 公司产品，含梨形鞭毛虫抗体磁珠、隐孢子虫抗体磁珠、SL 缓冲液 - A、SL 缓冲液 - B（十二）DABCO / 甘油镜检固定液：溶解 2.0 g 的 1,4 - diazabicycle [2.2.2]octane（DABCO, Sigma ＃D - 2522）于 95 mL 的加热的甘油 / PBS 溶液（60 ％ 的甘油，40 ％ 的 PBS），用磁石搅拌直至 DABCO 完全溶解，再加甘油 / PBS 溶液至 100 mL。保存期限为 6 个月。DABCO 加热时会产生有毒蒸汽，预避免吸入或与皮肤、眼晴接触。
（十三）隐孢子虫 / 梨形鞭毛虫免疫抗体检测标记套组：Meridian 公司产品（品号 250050 或同级产品，含对比染液counterstain、检测试剂 detection reagent 及洗剂 wash buffer）。储存于 0 至 8 ℃，不能冰涷，使用前回复至室温，本产品须避光保存，试剂稀释之后保存期限为 48 小时。
（十四）DAPI（4’6’ - diamidino - 2 - phenylindole）染剂：　 储备液：溶解 2 mL 的 DAPI 于 100 ％ 甲醇中，避光保存于 0 至 8 ℃ 的冰箱，保存期限为 2 星期。　 染液：以 PBS 稀释 5000 倍，即取 10 μL 的储备液， 以 50 mL 的 PBS 稀释，使用前配制不得过夜使用。
（十五）卵囊体及休眠孢子标准添加液：具活性的的隐孢子虫及梨形鞭毛虫可以用加热 75 ℃ 以上一分钟或 37 ﹪ 福尔马林使之失去活性。
（十六）0.01 ％ Tween - 20 溶液：量取 1 mL 的 10 ％ Tween - 20 于 1 L 的试剂水中。

六、采样与保存
（一）水样现埸过滤或以 10 ～ 20 公升的塑料桶采集，运送至实验室进行过滤浓缩分离等步骤。样品运送及保存应保持在0至8℃。但不得冰冻。
（二）样品在采样之后的 72 小时之内要完成前处理，已染色之样本玻片应保存在暗处及 0 至 8 ℃ 冰箱中。
（三）已染色样本最好能立即镜检观察，至迟在 72 小时之内要完成观察计数。如果染色之效果不佳，则必须缩短保存期限或者提高 DAPI 染剂之浓度。

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