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DNA末端标记技术
由于核酸内切酶的作用，凋亡细胞DNA降解产生缺口和3-OH末端，所以在组织
切片或固定细胞上选用标记的DNA探针进行原位标记。其中一种方法称为原位
缺口转译(In situ nick translation)，另一种方法为末端核苷酸转移酶介导的
dUTP末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-nediated dUTP nick
end labeling, TUNEL)。以上方法中，DNA片段的3-OH末端可在DNA聚合酶或
TdT作用下，用生物素(Biotin)、地高幸(Digoxin)、放射性核素(Radionuclide)或
萤光素(Fluorescein)连接的dUTP进行标记，生物素和地高辛标记可通过组织化学
法显示，放射性核素用放射自动显影，萤光素可在萤光显微镜下观察，也可以
流式细胞仪测定。TUNEL技术的敏感性更高。DNA末端标记技术的优点是：
(1)能够在组织切片上辨别形态学早期难以辨别的凋亡细胞；
(2)与流式细胞仪
(Flow cytometry)分析结合，可定量测定凋亡细胞的百分比；
(3)与免疫萤光染色
结合，可辨别不同细胞的凋亡情况。
流式细胞仪分析
流式细胞仪可从以下途径反映凋亡细胞的特性：
(1)DNA含量：由于DNA分子被降解，DNA特异性萤光染色减少。
(2)细胞膜的完整性：凋亡细胞的细胞膜始终保持完整，在细胞膜通透性处理前
不被碘化丙啶染色，坏死细胞则被染色；细胞膜通透性处理后再染色时，凋亡
细胞的萤光强度低于正常细胞。因此，运用不同的核酸染色可区分凋亡细胞、
坏死细胞和正常细胞。
(3)粒线体与溶酶体：凋亡细胞的粒线体跨膜电位仍然存在，因此可滞留染料
Rhodamine 123。凋亡细胞保持了ATP依赖性溶酶体质子帮浦活性。
(4)蛋白质：凋亡细胞中蛋白酶激活后，蛋白质含量减少，因而以
Sulforhodamine 101(SR 101)染总蛋白，凋亡细胞较正常细胞少，而坏死细胞仅
微量。
(5)凋亡细胞：凋亡细胞前向散射减少，侧向散射不变或升高。
利用流式细胞仪来检测凋亡细胞特性的方法有：
(一)亚G1峰的检测法
处于增殖周期的细胞，根据其所处不同周期时期(G0/G1、S和G2/M)，其DNA含
量分布在2n~4n之间。发生细胞凋亡的细胞由于细胞核内DNA裂解成许多小片
段，在酒精固定后，用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过细胞膜而丢
失，仅剩下大片段DNA这些失去部分DNA含量的细胞，在DNA染色后，形成一
个DNA含量小于2n(即小于G1时期细胞)的分布区，称为亚G1峰。
在经诱导后产生凋亡的细胞，在其DNA含量的组方图(Histogram)上，在G1峰前
会出现一个呈高斯分布的峰，即为亚G1峰，从分析峰的百分比即可得出凋亡细
胞的百分比。而在正常细胞或会自发性产生细胞凋亡的细胞，其亚G1峰的百分
比不会超过5%。另外，发生坏死的细胞或机械性损伤的细胞在G1峰前不会呈现
高斯分布的亚G1峰，但可出现一个连续的DNA小片段分布曲线，以此就可和细
胞凋亡区分开来。
(二)末端转移酶标记技术
凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活，细胞核DNA被切割成许多双股
DNA片段以及高分子量DNA断裂点(缺口)，暴露出大量3’-OH末端，如果用带有
绿色萤光(FITC)的末端转移酶和带有红色萤光(PI)来将细胞染色，这种带有双重
萤光讯号的细胞经流式细胞仪分析后，则可显示出不同细胞周期时期的细胞凋
亡情况。
在利用此测定方法和经流式细胞仪分析后，凋亡细胞的表现为可被PI和FITC同
时染色，而未进行细胞凋亡的细胞仅会被PI染上萤光，因此可利用这样方式将
凋亡的细胞和非凋亡的细胞区分开。

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