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细胞内胞器或蛋白质分布,免疫染色,显微镜与基因转染技术!

在细胞继代培养中，我们使用37度水浴预热培养液及Trypsin溶液，是为了达到恒温动物的体温范围，为细胞适应的正常温度。培养液中的成分有胎牛血清作为养分来源、抗生素以及胺基酸。Trypsin溶液为可破坏细胞黏着性的物质，故其可使细胞脱离培养基底，而血清中含有破坏Trypsin的物质，所以当加入含10 % 胎牛血清之DMEM培养液时可终止Trypsin的作用

运用了抗体与抗原高度专一结合的特性，进行免疫染色法。抗原为能刺激淋巴细胞产生抗体的异己蛋白质；抗体分单株抗体和多株抗体，单株抗体是由已经建立的融合瘤细胞所产生的而多株抗体为动物生产的传统抗血清。免疫染色法即先使用一级抗体辨识已知会位在特定胞器的抗原，再使用具有萤光标定的抗一级抗体的二级抗体，辨识一级抗体及抗原的所在位置，由此得知胞器的所在。之所以使用二级抗体，是使其将一级抗体的讯号放大，再使用萤光标定其位置。

还运用了基因转染（gene transfection）的方法，将VSVG-GFP以及ARL1QL的质体送入细胞中。而基因转殖根据不同的运送模式可分为三种：物理性方法、化学性方法和重组病毒感染法。较常用的方法有物理性的电穿孔法、化学性以DNA-磷酸钙颗粒经胞饮作用进入细胞以及我们本次实验的以脂质体媒介包埋。以脂小体为载体将DNA转染至细胞内的方式，其主要机制虽不全然清楚，但知DNA带负电之磷酸根会与脂小体表面之正电荷结合，脂小体带正电荷的部分又会与细胞表面带负电荷的分子结合藉以进行转染。另外，实验过程中，我们曾有脂小体造成细胞死亡的经验，由此得知脂小体对细胞有伤害性。而事实上，只要细胞接受了转染作用，不管是用哪种转染法，对细胞的毒杀性是普便存在的。市面上各种不同的脂小体主要的差异是在它们脂质的成分、比例，而这些脂质有许多都是因为要增加转染的成功率，所特地制造出来的化学成分，亦即它们对细胞膜而言不是天然的组成，所以推测脂小体对细胞的毒杀性是因为这些外生性的脂质所造成的。

实验观察中，我们运用了特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，使带萤光标记的抗体和胞器中的抗原进行抗原抗体反应，这样两者的结合体就能透过抗体的萤光观察到。而利用萤光蛋白或具有萤光标定的抗体标示蛋白质的原理为，当萤光物质（萤光染剂）受到较短波长的光及足够的能量所激发，当要回到稳态的能阶时，会释出较长波长的萤光，如：来自水母的绿色萤光蛋白基因，其激发光谱约为488nm，释放光谱约为507nm。

结论

（一）透过该次的实验，让我们得知要了解细胞内胞器或蛋白质的分布，免疫染色、显微镜与基因转染的技术是相当重要的。

（二）观察运输系统的存在。CTB-594是一种细菌毒蛋白质，会经内胞作用而运送至高基氏体；Tf-488 nm是一种运铁蛋白质，也会经内胞作用而运送至高基氏体；而VSVG-GFP是在细胞内合成后，会经由内质网运送至高基氏体，再运送至细胞膜。

（三）证明ARL1分子会调节蛋白质的运输作用。因为大量表现其突变株（ARL1QL），造成VSVG-GFP无法顺利送至细胞膜上，而堆积在高基氏体。


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