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正文:

微囊虫病

一级初步诊断：
从发病牡体之内收肌，触鬚及外套膜，特别从绿色脓疱病灶，行涂抹染色检查，染色液可使用Wright、Wright-Giemsa或相当染色液如Haemacolor、Diff Quick，于检下可见虫体呈现嗜硷性细胞质、嗜酸性细胞核，外形似小球状或卵圆形，具有二核融合细胞虫体（2至4μm宽），寄生或游离于泡状细胞，有时寄生于血淋球内。
二级初步诊断：目前尚无培养此虫体的方法。
三级初步诊断：
由组织病理学镜下观察，从罹病牡体之泡状结缔组织细胞内可见2至3μm大小之寄生虫体，亦可于肌细胞或血淋球内观察到病原；而鲁夫来微囊虫（M. roughleyi奥洲冬季死亡症之病原，一般本病原为养殖雪梨牡犡（Saccostrea. commercialis）造成区别之重点，在于鲁夫来微囊虫所感染寄生的宿主细胞质会于週边，并取代细胞质产生空泡，称为细胞质性空泡（cytoplasmic vacuole），而其他波纳米亚虫（Bonamia spp.）与本病原无此变化特徵,同时鲁夫来微囊虫每个感染阶段都寄生于血淋球内，而本病原通常出现于损伤组织部位四週之空泡性结缔组织细胞内，见附表一。
一级确定诊断：
于罹病牡蛎体壁、内收肌、外套膜及唇鬚表面可见黄绿色5mm直径之脓疱，且常在外套膜表面之脓疡">脓疡病灶附近贝壳上留下棕色斑痕（brown scar）。
二级确定诊断：目前并无发现本病原具有特异性血清型。
三级确定诊断：
1.穿透式电子显微镜下检查，予波纳米亚虫之区别在于本病原核仁位于细胞核中央，并缺之粒线体及单孢子体之构造，而B. ostrea核仁呈偏侧位置（eccentric location）；至于本病原在电子显微镜下各种虫体形之变异，Hine et al，于2001年（R），有详细的报导，本文前述已有介绍，本病原三个虫体型的变异，可在泡状结缔组织细胞及血淋球内发现，本病原为细胞内絶对寄生性原虫，观察出虫体非常接近宿主细胞质内之粒綫体，此目的主要是获居宿主细胞的能量来源。
2.使用聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction, PCR）从SSU rDNA区域分析，并设计出一组专一性之primers 5′-AGA-TGG-TTA-AGC-CTC-C-3′及5′-GCG-AGC-TGC-CAC-AAG-GC-3′估计放大之产物为546bp片段。在操作过程中，经淬取病原DNA后，加入各种反应物，并由最初变性（denaturation）94℃，10 分钟40循环、94℃、1分钟，60.5℃、1分钟，及72℃、1分钟，最后之扩展72℃、10分钟，其产物经1.5% agarose gal电泳，再由UV光检测产物；详细步骤可参阅世界动物卫生组织水生动物检验手册（Manual of diagnostic for aquatic animals, 2006）第2.2.5章infectrin with Mikrocytos mackini之内容。
3.FISH及ISH
萤光原位杂交法（fluorescent in situ hybridization, FISH）之检验步骤设计，係使用4个oregon green标示于寡核苷酸探针上（oligonucleotide probes），其探针序列为Mackini-1-OG：AGC-CCA-CAG-CCT-TCA-C， Mackini-2-OG：CCG-CCC-TTC-TCA-
GGT-C； Mackini-3-OG：CGA-AAG-TGG-TAG-CTA-AAG；Mackini-4-OG：AGT-AGC-
CTG-CTT-CCA-CT再统各种操作程序，可参考Carnegie et al. 2003(R)，发表之文献。
原位杂交法（in situ hydridization, ISH），係经digoxignin标示探针Mackini-1-OG:
5′-AGC-CCA-CAG-CCT-TCA-C-3′-DIG上（Meyer et al. 2005,R），有效成功具专一性及敏感性的检出本病原于消化腺、鳃、心脏、肾及肠管等组织。
4.定序（sequencing）
将PCR产物经DNA定序后，再与基因库中编码AF477623比较对照其亲族关係，始可确诊本病原。在世界动物卫生组织（OIE）中规定要确诊本病原需经组织病理学（histopathology），抹片检查（imprints），PCR及ISH、DNA定序及穿透式电子显微镜检查均为阳性反应后，才能最后确诊。