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正文:

以HPLC纯化蛋白质-生物显微镜技术

此法亦有以分子大小, 离子交换, 逆相, 厌水性交互作用等不同方式.

HPLC适于微量蛋白质的分离, 且可在短时间内达成. 逆相法场会使蛋白质分子失去生物活性, 离子交换与厌水性法均无此缺点, 分子大小法所分的分子大小范围会比普通用的柱状层析小一半, 且可对很小量的样本进行分离. 此处仅介绍以分子大小来分离蛋白质的方法. 此法依蛋白质分子大小, 大分子先分出, 小分子后分出.

材    料：

degassed, HPLC-grade H2O
size-exclusion(SE) buffer
SE protein standards
0.75×30cm SE column

方    法：

1.将保存液(storage solvent) (此处使用methanol)由column中洗除(用degassed HPLC-grade H2O), 以flow rate 1ml/min.

(在使用完之后, 以水洗去buffer salts, flow rate 1ml/min 30min, 再以methanol洗column 30min, 1ml/min)

2.在室温下使SE column平衡于1ml/min, H2O中.

3.试测一次, 以100μl SE buffer来测, 将结果列印纸上画上一横表示开始处, 并设定纸的速度为0.5cm/min, 而吸收度的单位则应依蛋白质浓度调整, 0.1宜于100pmol, 0.3宜于500pmol, 0.5宜于1nmol,1.0宜于2nmol, 若结果显示有污染之峰波, 且经一在测验均无法消除, 则buffer或column或二者均要更换了.

4.将SE蛋白标准液离心5min, 2,000xg, 抽取100μl测试, 如果峰高超过列印纸大小, 可调整之, 若结果比void volumn大于2.5倍以上, 则表示蛋白质吸附在column上.

5.决定每个峰的elution volume, 在绘以log10为纵轴, 各峰之elution volumn(ml)为横轴的图, 以便做测未知标本的参考.

6.接下来座标本. 方法比照过程3, 4.

SE buffer配方：

20mM Sodium acetate, pH5.6

150mM NaCl

SE protein standards：

2.0mg thyroglobulin

4.0mg catalase

3.0mg bovine serum albumin

3.0mg ovalbumin

4.0mg ribonuclease A

再加6ml SE buffer并缓缓溷合, 必须完全溶解, 并应在显微镜下查看无沉淀后, 在离心一次, 取上清液使用.

附注：

1.SE HPLC 层析法, 所得的每个蛋白质的elution volume与各蛋白质的log10(分子量)有关.

2.SE buffer亦可用Sodium phosphate(pH5~8)并含0.1~0.4M之NaCl.

3.所得之结果可再以电泳法来测分子量.

4.SE-HPLC层析柱之选择, 可参考如下：

Toya Soda SW

G 2,000 SW 用于分子量30,000以下

G 3,000 SW 用于分子量30,000至500,000

G 4,000 SW 用于分子量500,000

出自http://www.bjsgyq.com/北京显微镜百科