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正文:

免疫光学显微镜术

免疫金之免疫组织化学法
免疫光学显微镜术
1. 固定：小片组织放入下列固定液：2％对位甲醛（paraformaldehyde），1.25％戊二醛（glutaraldehyde），以50 mM PIPES pH 7.2之缓冲液配制，含2 mM CaCl2。把组织样品在4℃下固定12-24小时。
2. 包埋：用50 mM PIPES缓冲液冲洗被固定的组织3次，每次15分钟。以酒精系列进行脱水（30、40、50、60、70、80、95、100％×2酒精）；每个步骤10到15分钟。将组织以石腊包埋。避免温度超过58℃以上。
3. 切片：切下厚度5 m并黏贴在载玻片上。使用卵蛋白素（ovalbumin）或组织黏着物当作黏剂。若以Poly-L-lysine当黏着剂会有较深的背景色。假如可获得干净的载玻片就不要使用任何黏着剂。因为黏着剂会有一些背景颜色。
4. 脱腊：以二甲苯（xylene）脱腊
              二甲苯I        5分钟
              二甲苯II        5分钟
5. 水化：依序以系列酒精水化：
              95％酒精        5分钟
              95％酒精        5分钟
              85％酒精        5分钟
              70％酒精        5分钟
              50％酒精        5分钟
              蒸馏水        5分钟
6. 清洗和染色：
(1) 此反应需在潮湿状态下完成，且使用抗体的量尽量减到最少的程度，
   即要在最少量缓冲液中完成反应。
(2) 用PBS清洗                                     5分钟×2
(3) 将载玻片平放，取Blotto 50-200 l覆盖在材料上，浸泡20分钟到1小
   时。
(4) 以PBS冲洗。
(5) 加50-200 l的一级抗体（以Blotto适量稀释或以preimmune serum当对
   照）于材料上。
(6) 以PBS冲洗。                                   15分钟×4
(7) 加ImmunoGold（或protein A）于材料上。1小时（以Blotto稀释）。
(8) 以PBS冲洗。                                       15分钟×3
(9) 用蒸馏水冲洗。                                     15分钟×3
(10) 将切片放在通风处使其干燥，让其够牢固以完成接下来的步骤。
7. 银粒子强化反应：此处理步骤将免疫金粒子（步骤）经由银粒子予以强化放大，使它可以在显微镜下观察。此反应依厂商（Amersham Enhance M or Sigma Silver enhancer Kit）所附的操作说明进行即可。
8. 复染：将切片以0.5％SafraninO或Delafield Haematoxyliny浅染色几秒钟（3-5秒），使组织轮廓可在显微镜下观察。
9. 封片：滴一滴洋杉油在切片上进行封片，或暂时以指甲油封住盖玻片的四周，此时制片工作即告完成。

试剂制备：
1. PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS 10 mM）将下列盐类溶于100 ml水中：8 g NaCl、 0.2 g KCl、 1.44 g Na2HPO4•2H2O和0.2 g KH2PO4。
2. Blotto：PBS含0.1％BSA及0.05％sodium azide的PBS，并调整pH为7.2。
3. Preimmume serum：5％heat-inactivated normal serum（from the same species as that in which the gold-conjugated secondary antibody was raised）在Blotto中。
4. 免疫金（Immuno Gold or Auro ProbeLM or protein A）用40倍的Blotto溶液稀释。
5. Silver enhancer：solution A：B=1：1，使用前再溷合。solution A as enhancer, solution B as initiator。

出自http://www.bjsgyq.com/北京显微镜百科