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冷冻切片法

前准备器材及消耗品
冷冻切片机
subbing 载玻片
冷冻包埋剂 (cryo tissue embedding compound)
明视野显微镜
解剖显微镜
 
解剖显微镜生物标本之物理脱水及化学急速脱水法

物理脱水法：
    已固定之标本经洗涤后将固定液洗除后即可进行脱水及包埋于石腊或塑料中。脱水之步骤是以脱水剂如乙醇或丙酮由低浓度渐进至高浓度以物理取代之方式将组织中的水置换出来，使标本最终达到无水之状态。由于脱水剂系有机之药品且组织内外急剧的浓度改变，产生物理性之压差易造成组织形态上的改变，因此起始之脱水浓度及每一步骤之浓度差，需参考材料之软硬程度或组织是否为分生组织等纤细之性质。一般而言较细嫩的材料，如作细胞观察或电子显微镜标本之制备，须由较低浓度开始脱水如10％，且每一步骤之浓度差距须较小如10-20％。而较硬的成熟组织或作一般组织观察之目的，则可由较高浓度开始脱水如30％，且每一步骤之浓度差距可较大如20-30％。此外，起始脱水浓度和固定液的使用浓度需相近。常用的酒精脱水系列之浓度为10％－30％－50％－70％－85％－95％－100％，每一步骤之脱水时间可视材料大小而异，小材料如细胞或根尖，可以30分钟-1小时为一级距，大材料块则以4-8小时为一级距。有些材料经脱水后呈透明无色状，可于脱水过程中加入erythrosin或toludine blue同时进行表面之染色，使材料经包埋后易于辨认其外形或上下方向。染料于何时加入进行染色，则视其最佳溶解度，需与溶剂的浓度相配合，如toludine blue则适合于纯TBA时加入少许进行染色。材料经包埋切片后黏贴于载玻片上，其脱水之情形大致同上述。
上述的物理脱水法过程繁复费时且总程时间冗长，但效果稳定可靠分别为其缺点与优点。
化学脱水法：
另一种原理完全迥异的脱水法称为化学急速脱水法（Lin et al. 1977）。它是基于化学反应之原理，A＋B     C＋D若Ａ代表组织中所含的水，B是脱水剂，经反应后生成不同的化学产物C和D，于是组织中的水于瞬间完全消失而达到脱水的目的。反应中使用的脱水剂可以是双甲氧基丙烷2,2-dimethoxypropane（DMP）或双乙氧基丙烷2,2-diethoxypropane（DEP）。进行下式之反应
    CH3                                      O
          ∣                                       ∥
H3CO－C－OCH3  ＋  H2O      2 CH3OH  ＋CH3－C－CH3
          ∣
          CH3 
               
        2,2-DMP＋H2O                methanol  ＋  Acetone
此反应所用之DMP需经酸予以酸化，进行此步骤可于25 ml之DMP中加入3滴（每滴约0.06 ml）之0.1 N HCl即足够，若过度的酸化，将使脱水之组织其蛋白分子上羧基之H离子被生成物甲醇之甲基取代而形成所谓之甲基化，经甲基化之组织将失去蛋白分子被染料分子染色的性质，而形成负染之现象，应予避免，除了上述避免过度酸化外亦可将脱水步骤快速重复三次（每次5分钟），如此即可将生成物移去，而排除形成甲基化之机会。
    由于化学脱水之产物甲醇及丙酮，均为物理脱水之最终目的产物，因此理论上脱水过程系于瞬间完成，且水一碰上脱水剂之瞬间就完成反应，因此物理脱水过程中，因浓度差异所造成之物理压差并不存在，皆为此方法之优点。
化学急速脱水之简略参考流程如下：
2％glutaraldehyde固定液，以0.1 M cacodylate缓冲液pH 7.4配制
在4℃固定1小时
↓
以0.1 M cacodylate缓冲液淋洗3次，每次5分钟
↓
以2％OSO4之水溶液进行后固定1小时
↓
以二次蒸馏水淋洗3次，每次5分钟
↓
以酸化的DMP脱水，15分钟内更换3次新配的DMP
↓
（以100％之丙酮取代DMP）
↓                                   ↓                  ↓
塑料包埋                          石腊包埋         临界点干燥
↓                                   ↓                  ↓
超薄切片       2 切片              8－30切片         镀金
↓              ↓                   ↓                  ↓
铀及铅染色  Toludine Blue染色   Safranin, Fast Green染色 SEM观察
↓              ↓                   ↓
TEM观察       LM观察             LM观察