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详细解说定位杂交的原理和步骤

首先 in situ hybridization 中文叫做原位杂交, 跟南方或北方点墨法最大的不同,是可以看到目标的正确位置, in situ 就是这个意思 ,

所以虽然点墨法的敏感度远大于 in situ hybridization ,但仍有许多实验需要眼见为凭,或是知道正确位置,故原位杂交技术历久不衰,

所以要进行这个实验基本要求是目标(target)的完整性与正确性,如果是做染色体的,需要将完整的46条固定在玻片上(以人为例),若是

做胚胎发育的,需要小心的水解完整的胚胎,做病理切片的要小心去除封蜡,总之ISH第一步就是要准备好目标

第二步要准备DNA探针,10多年前多用成色法或是Isotope,但成色法解析度太差,Isotope又太危险, 所以现在ISH的技术都採用萤光

标定(Fluorescence) 即现在大家最常听到的原位杂交 Fluorescence in situ Hybridization; 简称FISH 后来FISH衍伸其他技术例如

GISH, CGH, SKY 等等,但无论何种方法都是把萤光物质标定在DNA之上

第三步进行杂交 如果你的目标是DNA 则玻片和探针都要进行denature之后,降温,让探针附着在目标上,若目标是RNA则不需要,当

然这其中牵涉到许多buffer的控制,温度的微调,以及清洗的效果等等,这些都是要靠经验去调整的

最后一步,需要ㄧ台萤光显微镜, 现在萤光显微镜配上四个滤片应该不是很贵,大概30万就可以搞定了,但最重要的还是ㄧ双有经验的

眼睛去找出你的目标固定在何处,不然花花绿绿的萤光影像让人眼花撩乱,是需要ㄧ段时间训练才能找出正确目标的

我在今年的FISH研讨会上看到有厂商推出可以自动寻找目标的萤光显微镜,很神奇,大概80万左右吧,我猜,这样可以省掉训练初学者

的时间,但可能又要花一些学软体的时间

出自http://www.bjsgyq.com/北京显微镜百科