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光学显微镜观察
依据 Christie and Edwardson (1977) (7) 之 C a l c o m i n e
orange-Luxol brilliant green 染色法观察内含体。撕取洋桔梗罹病叶片表皮并以 5% Triton X-100 处理 5 分钟。再以
1% Calcomine orange -1% Luxol brilliant green 染液 ( V / V＝
9: 1 ) 染色 1 0 分钟后吸除残馀染液，在 9 5 % 酒精中脱色 1 0 -
2 0 秒，放入 2 -甲氧基乙基醋酸 ( 2 - m e t h o x y e t h y l a c e t a t e ) 中
1 0 - 1 5 分钟，于载玻片上封片，再行光学显微镜检，并以
健康植株做为对照。
电子显微镜观察
阴染法：机械接种 L N V 发病之洋桔梗或奎藜叶片组
织粗汁液与 0.1% bacitracin (1 : 1 ) 溷合，依 Christie et al.
( 1 9 8 7 ) 方法 (8) 以铜网吸附前述溷合液，再以 2 % 醋酸铀
(uranyl acetate) 染色；纯化之病毒悬浮液经 2 % 甲醛
( f o r m a l d e h y d e ) 固定后，依前述方法染色并以电子显微镜
(JEM-200CX, JEOL) 观察病毒颗粒之形态。
超薄切片法：经机械接种之洋桔梗罹病叶片及花器等
组织，分别以 2 % 戊二醛 ( g l u t a r a l d e h y d e ) 及 1 % 四氧化锇
(osmium tetroxide) 做前、后固定，再以酒精系列脱水和
LR White 树脂渗透包埋后，于超薄切片机 ( R e i c h e r t
ultracut S) 切取 60-70 nm 厚度的切片，经 2 % 醋酸铀溶液
染色后以电子显微镜观察罹病组织之病变情形。
抗体
试验使用之抗体包括 L N V 老鼠单元抗体细胞培养液
( 7 E S - 3 G - 1 0 ) 由国立中兴大学植病系陈煜焜老师製备供
用；L N V 日本分离株兔子抗血清由 D r. Iwaki (15) 赠用；
L N V 台湾分离株兔子抗血清由本实验室製备，製备时将
纯化之病毒经电泳分离 ( 11 )，析取 38 kDa 病毒鞘蛋白做为
抗原，每週一次，经连续四次肌肉注射纽西兰白兔，第五
週起进行耳朵静脉採血，所得抗血清，保存于 - 4 0℃ 备
用。本试验仅于初期鑑定病毒种类时使用日本分离株兔子
抗血清，其馀相关之血清学试验均使用 L N V 台湾分离株
兔子抗血清 (除有说明需要，以下均简称兔子抗血清) 或老
鼠单元抗体细胞培养液 (除有说明需要，以下均简称老鼠
单元抗体)。
酵素连结免疫分析
间接酵素连结免疫分析 (indirect ELISA) 係依 K o e n i n g
( 1 9 8 1 ) (17) 之方法进行。供试植物叶片以 9 倍量 ( W / V ) 之涂
覆缓冲液 (coating buff e r, 1.59 g Na2C O3，2.93 g NaHCO3，
0.2 g NaN3，1000 ml H2O，pH 9.6) 研磨，取 2 0 0μl 置入
微量盘之孔穴中，于 3 7℃ 静置 2 . 5 小时后用 PBST (8 g
N a C l， 0.2 g KH2P O4，2.9 g Na2H P O4，7 H2O，0.2 g
K C l，0.2g NaN3，0.5 ml Tw e e n - 2 0，1000 ml H2O，p H
7 . 4 ) 清洗 3 次。加入以结合缓冲液 (conjugate buff e r, 2%
P V P - 4 0，0.2% ovalbunin ，1000 ml PBST) 稀释 1 0 0 0 倍之
L N V 免子抗血清或稀释 8 倍之细胞培养液老鼠单元抗体，
于 3 7℃ 静置 2 小时，用 P B S T 清洗 3 次，再加入以结合缓
冲液稀释 5 0 0 0 倍之硷性磷酸酵素标示之山羊抗兔子免疫
球蛋白 (goat anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate,
J a c k s o n )，老鼠单元抗体则加入 1 0 0 0 倍之山羊抗老鼠免疫
球蛋白 (goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugate,
J a c k s o n )。三层酵素连结免疫分析 (triple-antibody sandwich
ELISA, TAS- ELISA) 係依据 Hsu and Lawson (13) 之方法进
行，依序加入 L N V 免子抗血清球蛋白 ( 1 : 2 0 0 0 )、3 %
bovine serum albumm (BSA)、抗原、L N V 老鼠单元抗体细
胞培养液 ( 1 : 8 )，最后加入以 conjugate buff e r 稀释 1 0 0 0 倍
之 goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugate,
J a c k s o n。两种方法最后均于 3 7℃ 静置 2 小时或 4℃ 过
夜，水洗后，每穴加入 2 0 0μl 以 substrate buffer (97 ml
d i e t h a n o l a m i n e，800 ml H2O，0.16 g NaN3，p H 9 . 8 ) 配製
之酵素基质 (ρ-nitrophenyl phosphate，disodium, Sigma, 1
m g / m l ) 试液反应 2 0 - 6 0 分钟，每穴再加入 5 0μl 之 3 M
N a O H 停止反应，并以 E L I S A 测读仪 ( B i o - Tek Instruments,
Burlington, VT, USA) 读取波长 405 nm 之吸收值。健康对
照A 4 0 5 之读值的 3 倍为正反应之判定依据。
组织转渍法
直接组织转渍法 (direct tissue blotting，D T B ) 依 Lin e t
a l. (1990) (18) 及 Hsu and Lawson (1991) (14) 之方法进行。将
接种 L N V 发病之洋桔梗叶片撕起表皮或取其根、茎部
位，适力压渍于亚硝基树脂膜 (nitrocellulose membrane,
nitroscreen, DuPont)，随后浸于内含 2% BSA 与 1% Tr i t o n

X - 1 0 0 之 P B S，室温振盪 6 0 分钟后，浸于以 P B S稀释之
L N V 兔子抗血清 ( 1 : 1 0 0 0 ) 或老鼠单元抗体细胞培养液 ( 1 :
8 ) 于室温放置 2 小时或于 4℃ 过夜。连续三次以 P B S T 溶
液清洗 ( P B S 内含 0.05% Tween 20)，每次 1 0 - 1 5 分钟。亚
硝基树脂膜随之即浸于以结合缓冲液稀释 5 0 0 0 倍之 g o a t
anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Jackson于室
温放置 2 小时，以 P B S T 连续清洗三次，每次 1 0 - 1 5 分
钟，再行显色。
西方转渍法
西方转渍法( Western blot)分析时係将L N V罹病组织萃
取粗汁液 (粗汁液先经 1,000 rpm 离心 1 0 分钟) 或纯化病毒
悬浮液以解离缓冲液 (degrading buff e r ) 处理并于沸水煮 2
分钟后经S D S - PA G E电泳分离后，根据Gooderham (1984)( 1 2 )
之方法以蛋白转印槽 (Bio-Rad transblot apparatus) 将电泳
胶上之蛋白转印到转渍膜 (PVDF membrane, Millipore)
上，P V D F 转渍膜经浸于转印缓冲液 (transfer buff e r ) 清洗
后，再以对应兔子抗血清稀释液 ( 1 : 1 0 0 0 ) 或 L N V 老鼠单
元抗体细胞培养液 ( 1 : 8 ) 浸渍，P V D F 膜以 T S W 缓冲液
(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.9% NaCl, 0.25% gelatin, 0.1%
Triton X-100, 0.02% SDS) 清洗后浸泡于 goat anti-rabbit
IgG alkaline phosphatase conjugate, Jackson (1 : 5 0 0 0 )，
P V D F 膜再以 T S W 缓冲液清洗，最后行呈色反应。
病毒之接种及侦测
L N V 罹病洋桔梗叶片粗汁液以金钢砂机械接种于 5 - 6
叶期洋桔梗幼苗展开叶往下算第二对称叶即接种二叶片，
接种株置于 2 1 及 2 6℃ (恆温)，并于接种后第一天 ( 2 4 小
时)、第二天 ( 4 8 小时)及第三天 ( 7 2 小时)分别採取接种叶
片、根及茎，以 L N V 兔子抗血清利用 indirect ELISA 及
D T B 进行分析比较其侦测效力。试验重覆三次，每次每
一处理接种六株植龄相彷之植株，每日取样二株，其中之
二接种叶片 (每株一叶片) 供 indirect ELISA 分析，另二叶
片供为 D T B 分析。另以蒸馏水接种三株做为对照处理。